詳述PCR擴增帶異常的原因及解決方法

詳述PCR擴增帶異常的原因及解決方法

使用PCR時(shí)，較為常碰到的問(wèn)題就是會(huì )出現擴增帶有異。借此機會(huì )，我們與大家探討一下PCR擴增條帶有異時(shí)的原因及解決方案。   

假陰性，不出現擴增條帶
PCR反應的關(guān)鍵環(huán)節有①模板核酸的制備；②引物的質(zhì)量與特異性；③酶的質(zhì)量；④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應針對上述環(huán)節進(jìn)行分析研究。

模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)；②模板中含有Taq酶抑制劑；③模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白；④在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚；⑤模板核酸變性不*。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應固定不宜隨意更改。

酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。

引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱(chēng)，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱(chēng)擴增，對策為：①選定一個(gè)好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(cháng)期放冰箱冷藏部分，導致引物變質(zhì)降解失效。④引物設計不合理，如引物長(cháng)度不夠，引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低PCR擴增的特異性，濃度過(guò)低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

反應體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul 或100ul，應用多大體積進(jìn)行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。

物理原因：變性對PCR擴增來(lái)說(shuō)相當重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現假陰性；退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率，退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時(shí)還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會(huì )成功的。

假陽(yáng)性
出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。

引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴增時(shí)，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽(yáng)性。需重新設計引物。

靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應一次性使用。必要時(shí)，在加標本前，反應管和試劑用紫外線(xiàn)照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除。

出現非特異性擴增帶
PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不*互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及PCR循環(huán)次數過(guò)多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現非特異條帶而另一來(lái)源的酶則不出現，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì )出現非特異性擴增。其對策有：必要時(shí)重新設計引物。減低酶量或調換另一來(lái)源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次數。適當提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。