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                PCR應用中存在的問(wèn)題探索

                更新時(shí)間:2023-11-09      瀏覽次數:1105

                開(kāi)展 PCR 應具有一定的條件。需要一個(gè)正規的 pCR 實(shí)驗室,采集標本、核酸提取、擴增及產(chǎn)物分析應在不同的房間進(jìn)行;需有嚴密的防污染措施、假陽(yáng)性和假陰性結果的質(zhì)控等。實(shí)驗者應具有一定的分子生物學(xué)理論知識及實(shí)驗技能,能夠及時(shí)發(fā)現和糾正實(shí)驗中的問(wèn)題。目前,我國在 PCR 應用中尤其是在臨床診斷中存在問(wèn)題較多,主要表現為: PCR 試劑的考核、審查工作薄弱,許多單位實(shí)驗條件不符合要求,部分操作人員的理論和實(shí)驗知識水平較低。 PCR 的應用范圍過(guò)寬等,因此造成 PCR 實(shí)驗結果的可靠性差,出現較多的假陽(yáng)性、假陰性結果。
                一、假陽(yáng)性:
                  實(shí)驗中設立的陰性對照可提示有無(wú)假陽(yáng)性結果出現。如果一次實(shí)驗中的幾個(gè)陰性對照中出現一個(gè)或幾個(gè)陽(yáng)性結果,提示本次實(shí)驗中其它標本的檢測結果可能有假陽(yáng)性。造成假陽(yáng)性的原因包括樣品污染、擴增試劑污染、擴增產(chǎn)物交叉污染等。常見(jiàn)的污染來(lái)源包括實(shí)驗室環(huán)境、加樣器、操作中形成的噴霧、 DNA 抽提儀器、試劑及任何與擴增產(chǎn)物接觸的東西。預防措施:(1)工作區隔離。(2)改進(jìn)實(shí)驗操作,如在加樣過(guò)程中避免試劑飛濺、吸頭離心管使用前高壓處理、試劑分裝成小份一次使用后棄去等。(3)操作程序合理化,如后加陽(yáng)性對照等。
                  交叉污染的處理方法: 交叉污染指擴增產(chǎn)物對將要擴增的樣品或反應管的污染。由于 PCR 的敏感性和效率特別高,所以少量的擴增產(chǎn)物污染標本或反應管即可出現假陽(yáng)性。交叉污染的處理方法包括 [1] :
                1 .在 DNA 模板和多聚酶加入前,紫外線(xiàn)照射反應管內容物以破壞污染的 PCR 產(chǎn)物。一般選用波長(cháng) 254nm 照射 30min ( Nature , 1990 , 34:27 )
                2 . PCR 實(shí)驗中使用 dUTP ,而不用 dTTP 。在擴增前使用 UraciI N 一 g1ycosylase (尿嘧啶糖基化酶)處理可降解交叉污染的 PCR 產(chǎn)物,而不降解基困組 DNA 模板,然后熱滅活此酶,再進(jìn)行擴增反應( Gene , 1990 , 93 : 125 )。美國 PE 公司提供此類(lèi)試劑盒( PCR carry-over preventionkit 。
                3 .在 PCR 反應前加入一種光化學(xué)試劑,反應完成后激活該試劑,光化學(xué)試劑可交聯(lián) DNA 鏈,使之不能再擴增( Nucleic Acids Res , 1991 , 19 : 99 )。
                二、假陰性:
                  如果實(shí)驗中設置的陽(yáng)性對照未能擴增成陽(yáng)性結果,提示本次實(shí)驗中可能有假陰性結果。但這里應注意,許多國產(chǎn) PCR 試劑盒中陽(yáng)性對照采用質(zhì)粒 DNA ,和標本相比來(lái)說(shuō),不需純化提取核酸的步驟,因此,如果在標本核酸純化提取步驟有問(wèn)題,即使陽(yáng)性對照均呈陽(yáng)性,標本檢測中還可能有假陰性。
                  造成假陰性的原因包括: (1) DNA 抽提過(guò)程不當。 (2) DNA 樣品中含有 Taq 聚合酶抑制劑,如尿素、 DMSO 、 SDS 等物質(zhì),可抑制 Taq 酶活性, DNA 樣品中的蛋白質(zhì)和重金屬離子等亦影響 Taq 酶活性,尤其是含有較多膿液或分泌物的標本,其中雖有待查菌,但卻因標本處理不當而出現假陰性 [2] 。
                  設置內對照是判斷假陰性較好的指示系統。在每一反應管中加入內對照,若內對照未能擴增出來(lái),說(shuō)明該反應管的結果可能有問(wèn)題。
                三、PCR產(chǎn)物的鑒定
                  PCR 產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳可判斷其長(cháng)度是否為預期的長(cháng)度,但只有通過(guò)雜交試驗或序列分析等才能判斷其特異性。嚴格說(shuō)來(lái), PCR 產(chǎn)物均應通過(guò)實(shí)驗證實(shí)其特異性。在我國一些科研論文和臨床檢測中缺乏這一環(huán)節。
                  綜上所述, PCR 具有其優(yōu)點(diǎn),但也有不足之處,它是一種很好的科研手段,但作為常規診斷方法尚需進(jìn)一步改進(jìn)和提高 [9] 。目前的關(guān)鍵問(wèn)題是如何正確應用 PCR 。雖然 PCR 尚未在包括美國等發(fā)達國家作為常規診斷方法,但如果具備開(kāi)展 PCR 需要的條件, PCR 是可作為輔助診斷手段使用的。目前,只有針對 PCR 應用中存在的問(wèn)題,采取措施,正確應用 PCR ,才能使這一技術(shù)在科研和臨床工作中發(fā)揮應有的作用。

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